对蛋白质进行标记和偶联操作可以赋予其新的功能，便于检测、定位或者用于构建复杂的生物分子体系。其中，基于氨基反应的蛋白质标记和偶联方法是一类非常重要的技术手段。

1、氨基在蛋白质中的存在形式与特性

1）氨基酸结构中的氨基：蛋白质由氨基酸组成，许多氨基酸都含有氨基基团（-NH₂）。在组成蛋白质的20种常见氨基酸中，例如赖氨酸（Lys），其侧链上含有一个可反应的氨基。这些氨基在蛋白质的三维结构中分布在不同的位置，有的暴露在蛋白质表面，容易与外界试剂发生反应，而有的可能由于蛋白质折叠而被包埋在内部，不易被触及。

2）氨基的化学性质：氨基具有一定的碱性，可以接受质子形成 -NH₃⁺。这种碱性特性使得氨基在不同的pH条件下具有不同的反应活性。在偏中性到碱性的环境中，氨基能够与带有活性官能团的化合物发生亲核取代反应或缩合反应等。氨基可以与羧基发生缩合反应形成酰胺键，这一反应在蛋白质偶联过程中经常被利用。

2、常见的基于氨基反应的蛋白质标记和偶联方法

1）戊二醛法：戊二醛是一种带有两个活性醛基的双功能连接剂。它能够借助两端的醛基与蛋白质的氨基以共价键连接。反应机制涉及到醛基与氨基首先反应生成亚胺（西佛碱，schiff base）。反应条件相对温和，可以在4-40°C，pH 6.8-9之间反应，反应时间通常控制在2-5小时。一般室温下即可反应，如果反应物活性较高，也可以在4°C条件下反应。在磷酸缓冲液（pH6.8- 7.5）或者碳酸缓冲液（pH8-9）中都能进行反应，而且通常pH越高，西弗碱的生成率越高。这种方法的优点是操作简单，连接效率较高。然而，也存在一些局限性，例如生成的西佛碱在反应条件下不是很稳定，可能会发生进一步的聚合反应，需要对反应条件进行精确的控制以确保偶联的稳定性。

2）碳化二亚胺法：碳化二亚胺类试剂（如EDC）是常用的偶联试剂。它能够活化含有羧基的化合物，使其与蛋白质的氨基发生反应形成酰胺键。在反应过程中，碳化二亚胺首先与羧基反应形成一个活性中间体，这个中间体随后与氨基反应完成偶联。反应通常在水相体系中进行，并且可以通过调节pH来优化反应效率。一般来说，pH在4.5-6.0之间比较适合。优点是可以在水溶液中进行反应，对许多生物分子的活性影响较小。但是，反应过程中可能会产生一些副反应，需要对反应体系进行适当的优化以提高特异性。

3）重氮法：芳香族伯胺在低温（0 - 5°C）和强酸（盐酸或硫酸）溶液中与亚硝酸钠作用，生成重氮盐的反应称为重氮化反应。若环上具有 -NO₂或 -SO₃H等的芳胺可以在较高一些（40-60°C）温度进行重氮化反应。重氮盐在弱酸、中性或碱溶液中与含有氨基的蛋白质作用，由偶氮基（N = N）将两个分子偶联起来，生成偶氮化合物的反应，称为偶联反应。这种方法的偶联反应是亲电取代反应，重氮阳离子是弱的亲电试剂，它进攻蛋白质氨基所在位置苯环上电子出现几率密度比较大的碳原子。反应需要严格控制反应条件，包括温度、pH和反应物浓度等，以确保反应的特异性和效率。

3、蛋白质标记和偶联过程中的关键因素

1）缓冲液体系：缓冲液的种类和pH值对氨基反应的偶联过程至关重要。不同的偶联方法可能需要特定的pH范围来确保反应的最佳效率。例如，碳化二亚胺法在pH4.5-6.0之间较为合适，而戊二醛法在pH6.8-9之间反应较好。合适的缓冲液还可以维持蛋白质的结构和活性，防止蛋白质在反应过程中变性。

2）反应温度和时间：反应温度和时间需要根据具体的偶联方法和反应物的特性来确定。一般来说，较低的温度可以减少副反应的发生，但可能会降低反应速率。戊二醛法在室温到40°C都可以反应，而重氮法需要严格控制温度在0 - 5°C或者40 - 60°C（根据芳胺的结构）。反应时间过长可能会导致不必要的副反应或者蛋白质变性，时间过短则可能导致偶联不完全。

3）反应物浓度和比例：蛋白质与标记或偶联试剂的浓度和比例会影响偶联的效率和特异性。如果标记试剂浓度过高，可能会导致非特异性结合或者过度修饰，影响蛋白质的活性。如果浓度过低，则可能导致偶联不完全。